uzluga.ru
добавить свой файл


Тема 3. Основы молекулярной биофизики

Предмет, задачи и объекты изучения молекулярной биофизики. Молекулярная биофизика изучает физическую структуру биологически важных молекул и физические процессы, лежащие в основе их функционирования. Основными объектами молекулярной биофизики являются белки и нуклеиновые кислоты. Кроме этого молекулярная биофизика изучает полисахариды. Под структурой молекулы понимают расположение в пространстве всех её атомов. В молекулярной биофизике характеристика молекулы включает в себя структурную химическую формулу, длины всех связей и углы между связями, распределение зарядов на поверхности, подвижность отдельных участков и изменчивость структуры в зависимости от параметров среды: температуры, ионной силы, рН, наличия определенных ионов. Основная задача молекулярной биофизики – выяснение связи физической структуры и свойств биологически важных молекул с выполняемой ими в организме функцией.

Общая характеристика структуры биополимеров. Первая особенность молекул, синтезируемых в живой клетке – их стереоспецифичность (хиральность). Стереоспецифические молекулы могут существовать в виде двух зеркально симметричных форм – стереоизомеров: правой (D-форма «+») и левой (L-форма «-»). Асимметрия определяет специфичность биохимических реакций. Стереоизомеры обладают одинаковой химической активностью, однако в живой природе хиральные соединения существуют обычно в какой-то одной форме. Организм различает L – и D-изомеры при поглощении извне и синтезируют соединения в одной стереоконфигурации. В живых организмах аминокислоты присутствуют в L-форме, а углеводы в D-форме.

Макромолекулы обладают несколькими видами изомерии. Различные изомеры одного и того же соединения, переход между которыми возможен только при условии разрыва и образования новых ковалентных связей, называются конфигурациями этого соединения. Примером конфигураций являются L- и D-изомеры. Если же переход из одного изомера в другой осуществляется за счет поворота вокруг одинарных ковалентных связей без их разрыва, то такие изомеры называются конформациями.

Вокруг одинарных атомных связей в молекуле может осуществляться вращение. Установлено, что не все значения углов поворота равновероятны. Наиболее вероятны значения углов поворота кратные 120°. В этом случае молекула находится в транс-конформации. Наименее вероятными считаются значения углов поворота – 60, 180, 300°. В этом случае молекула находится в цис-конформации. Причины, по которым транс-конформация является более выгодной, чем цис-, имеют квантово-механическую природу и заключаются в отталкивании близко расположенных валентно не связанных атомов, а также во взаимодействиях связей, примыкающих к оси вращения (эффект ориентации связей). Энергетически выгодные конформации, возникающие при поворотах вокруг единичных связей, называются поворотными изомерами. Молекула будет переходить из выгодной конформации в другую со скоростью, которая определяется высотой потенциального барьера, отделяющего эти конформации. Так, при высоте потенциального барьера около 12,5 кДж/моль время превращения одного поворотного изомера в другой составляет 10-10 секунды.

Белки и нуклеиновые кислоты представляют собой информационные макромолекулы, кодирование информации в которых осуществляется аминокислотным или нуклеотидным алфавитом. Макромолекулы полисахаридов состоят из одинаковых звеньев и поэтому не несут информации. Они выполняют либо опорную функцию, либо служат в качестве депо необходимых веществ.

Структура макромолекул имеет несколько уровней организации. Важная особенность структуры белков и нуклеиновых кислот заключается в стабилизации положения химических групп в пространстве с минимальной внутренней энергией. Это достигается за счет ковалентных, водородных связей и других связей. Первичной структурой называется последовательность мономеров, образующих полимерную цепь. В белках это последовательность аминокислот, в нуклеиновых кислотах – нуклеотидов. Первичная структура стабилизирована ковалентными связями, в то время как все остальные уровни организации – в основном слабыми связями (водородными, гидрофобными, электростатическими). Регулярное расположение в пространстве химических групп (пептидных в белках, пуриновых и пиримидиновых оснований в нуклеиновых кислотах) создает вторичную структуру биополимеров. Например, вторичная структура ДНК представляет собой двойную спираль, стабилизированную водородными связями между комплементарными азотистыми основаниями образующих спираль цепей.

Как известно из химии, вращение в молекулах вокруг одинарных связей приводит к появлению поворотных изомеров, то есть молекул с различной конформацией. В белках вращение вокруг пептидной связи С-N затруднено, так как эта связь имеет на 30-40% характер двойной связи вследствие резонанса. Поэтому белок можно рассматривать как цепь из связанных друг с другом плоских пептидных звеньев. Вращение этих звеньев возможно вокруг одинарных связей α углерода аминокислот. Угол поворота вокруг связи Сα С обозначается ψ, а вокруг N Сα φ. Полинг и Корн установили два основных варианта вторичной структуры белковой цепи: -α-спираль и β–форму. α-Спирали могут быть правозакрученными (φ=132 ̊, ψ= 123 ̊) и левозакрученными (φ=228 ̊, ψ= 237 ̊). β–Формы могут быть параллельными (φ=61 ̊, ψ= 239 ̊) и антипараллельными (φ=380 ̊, ψ= 325 ̊). Кроме того, в белках встречаются участки, не образующие регулярной структуры, так называемые неупорядоченные структуры, в которых одноименные углы φ и ψ неодинаковы. Например, в гемоглобине 75% аминокислот образуют правозакрученные α – спирали, а остальные участки являются неупорядоченными, они располагаются преимущественно в местах пространственных изгибов спирализованной цепи.

Возможность изгибов в цепи и наличие в молекулах белков различных взаимодействий между группами, далеко отстоящими друг от друга в полипептидной цепи, приводят к компактной укладке этой цепи. Расположение в пространстве элементов вторичной структуры и неупорядоченных звеньев полипептидной цепи называется третичной структурой белка. Различие между вторичной и третичной структурами условно, так как в действительности мы имеем дело с единственной пространственной структурой (конформацией) белка, состоящей из регулярных участков и неупорядоченных звеньев. Нативная молекула белка может состоять из нескольких полипептидных цепей, каждая из которых имеет определенную третичную структуру. Такие отдельные полипептидные цепи, не связанные друг с другом ковалентно, называются субъединицами. Структура, которая образуется при ассоциации субъединиц, называется четвертичной структурой белка. Число субъединиц в нативной молекуле белка постоянно. Этим четвертичная структура отличается от агрегатов молекул белка, образующихся при денатурации.

Изменение свойств окружающей среды: температуры, ионного состава, рН, концентрации малых молекул – может изменить баланс сил, определяющих данную конформацию белка, и вызвать переход белка в новую конформацию, стабильную в новых условиях. Такие перестройки в молекуле белка называют конформационными переходами.

Виды взаимодействий в макромолекулах. В биологически важных молекулах существуют несколько типов связей и энергии взаимодействий.

  1. Ионные связи образуются между заряженными атомами. Энергия ионной связи определяется по формуле: Wион = - q1q2/4πε0εr, где q1q2 – заряды взаимодействующих ионов; ε0 = 8,85•10-12 Ф/м – электрическая постоянная; ε – относительная диэлектрическая проницаемость среды; r – расстояние между ионами. Ионные связи в макромолекулах обусловлены присутствием ионогенных групп: карбоксильных и аминогрупп в белках, фосфатных групп в нуклеиновых кислотах. В биомембранах ионогенными группами являются фосфаты, а также карбоксилы свободных жирных кислот. За счет ионных связей образуются комплексы различных ионов с макромолекулами. Например, многие белки связывают ионы кальция, а нуклеиновые кислоты еще и ионы магния.

Для многих явлений в организме (мышечное сокращение, свертывание крови) важно образование комплексов ионов с макромолекулами. Образование этих комплексов происходит за счет ион-ионных и ион-дипольных взаимодействий. Например, связывание ионов кальция с фосфолипидами мембраны обусловлено ион-ионными взаимодействиями, а связывание мембранных ионов кальция с лекарственным препаратом – ион-дипольным взаимодействием.

  1. Ион-дипольные взаимодействия возникают между ионами и молекулами или атомными группами, обладающими дипольным моментом. Атомы, находящиеся на небольшом расстоянии друг от друга, взаимодействуют за счет ванн-дер-ваальсовых связей, которые включают ориентационные, индукционные и дисперсные взаимодействия.

  1. Ориентационные (диполь-дипольные) связи возникают между молекулами, обладающими дипольным моментом.

  2. Индукционное взаимодействие возникает тогда, когда молекула, имеющая постоянный дипольный момент, способна индуцировать его в соседней молекуле.

  3. Дисперсионные взаимодействия возникают между нейтральными или неполярными группами и имеют квантово-механическую природу. Например, взаимодействие углеводородных цепей друг с другом в липидной части биомембран.

Важную роль в формировании структуры макромолекул играют водородные связи.

3. Водородные связи образуются между группами, содержащими атом водорода, и атомами кислорода, азота, фтора, хлора за счет электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Эти связи обусловлены способностью самого малого атомного ядра протона проникать в электронные оболочки соединяемых им электроотрицательных атомов и их стягивать. Водородная связь является направленной и образуется только в том случае, когда все три атома, участвующие в её образовании, лежат на одной прямой. Водородные связи играют важнейшую роль в поддержании определенной вторичной структуры не только белков, но и нуклеиновых кислот. Одновременное образование большого числа водородных (слабых) связей в макромолекулах лежит в основе явления комплементарности, то есть строго структурного соответствия и специфичности связывания больших участков молекул.

4. Гидрофобные взаимодействия способствуют отталкиванию друг от друга неполярных незаряженных групп и молекул воды. Эти силы определяют формирование структуры биологических мембран и глобулярных белков.

Структура воды и гидрофобные взаимодействия. Большинство биополимеров функционирует в водной среде, и взаимодействие составляющих их мономеров с водой во многом определяет пространственную конфигурацию макромолекулы в целом. Причина столь важной роли воды в биологических процессах кроется в следующем.

В отличие от гидридов элементов VI группы (H2S, H2Se, H2Te) молекула H2O является диполем из-за своей асимметрии: линии, соединяющие центры атома кислорода с центрами атомов водорода, образуют угол 104,28°. Атом кислорода в молекуле воды расположен как бы в центре тетраэдра, в двух вершинах которого находятся атомы водорода. Две пары электронов кислорода, не участвующих в образовании ковалентных связей, находятся на вытянутых орбиталях, оси которых направлены к двум другим углам тетраэдра. Эти электронные пары несут локальный отрицательный заряд и обуславливают электростатическое притяжение между данной молекулой воды и атомами водорода соседних молекул. Благодаря этим взаимодействиям в жидкой воде формируются ассоциации молекул, называемые кластерами. Структура кластеров сходна со структурой льда. В кристаллах льда каждая молекула воды связана водородными связями с 4 соседями, при этом атомы кислорода соседних молекул также располагаются в вершинах тетраэдров. Такая кристаллическая решетка отличается рыхлостью: в кристаллах льда атомы расположены сравнительно далеко друг от друга, поэтому лед имеет довольно низкую плотность, более низкую, чем жидкая вода, в которой часть молекул располагается в полостях тетраэдрической кристаллической структуры. Вместе с тем даже после полного таяния льда в жидкой воде сохраняются льдоподобные структуры – кластеры. Между кластерами и неструктурированной частью воды постоянно существует обмен молекулами, так что в среднем каждый кластер живет всего 10-10 – 10-11 секунд. При 20 ̊С доля не связанных в кластеры молекул составляет 29,5%. С повышением температуры средний размер кластеров уменьшается, и доля несвязанных молекул возрастает. Кстати, именно с плавлением кластеров связана аномально высокая теплоёмкость воды.

В воде хорошо растворяются те органические соединения, которые содержат полярные группы и способны вступать в диполь-дипольные взаимодействия с молекулами воды или образовывать с ними водородные связи. Таковы, например, группы ОН, >С=О, NH2. Напротив, неполярные молекулы углеводородов плохо растворяются или совсем не растворяются в воде. Это объясняется тем, что при растворении молекулы углеводородов втискиваются в полости внутри тетраэдрических ячеек кластеров, вытесняя оттуда неструктурированную воду. Последняя образует новые кластеры, и упорядоченность системы увеличивается, а значит, энтропия уменьшается. Поэтому гидрофобные взаимодействия являются результатом свойств воды, а не каких-то особых сил, связывающих неполярные группы друг с другом. Таким образом, ассоциация неполярных молекул в воде за счет гидрофобных взаимодействий определяется выталкивающим действием воды на неполярные соединения, что обусловлено тенденцией молекул воды к достижению состояния максимальной неупорядоченности (максимальной энтропии).

Роль гидрофобных взаимодействий в формировании структуры белка. Аминокислотные остатки, входящие в состав полипептидной цепи, могут быть разделены на две группы: неполярные (гидрофобные) и полярные (гидрофильные). В формировании пространственной структуры белка определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Эту идею впервые высказали советские ученые Бреслер С.Е. и Толмуд Д.Л. в 1944 году. Идея состояла в том, что гибкая макромолекула белка в воде сворачивается в глобулу. Так как неполярные остатки белка стремятся к минимальному контакту с водным окружением, они начинают сворачиваться в шарообразную каплю. Полярные же радикалы белка стремятся к максимальному контакту с водным окружением, поэтому они образуют гидрофильную оболочку вокруг гидрофобной капли. В результате образуется глобула, которая имеет гидрофобное ядро и гидрофильную поверхность.

В 1964 году Фишер установил, что а) если количество полярных остатков в белке равно количеству неполярных, то молекула белка имеет шаровидную форму (глобула); б) если количество полярных остатков в белке больше, чем необходимо для того, чтобы покрыть гидрофобное ядро гидрофильным слоем, то глобула вытягивается в эллипсоид (фибрилла); в) если количество полярных остатков в белке меньше, чем необходимо для того, чтобы покрыть гидрофобное ядро гидрофильным слоем, то гидрофобные взаимодействия ведут к агрегации белков и возникновению надмолекулярных структур.

Формирование гидрофобного ядра в глобулярных белках имеет принципиальное значение для их функционирования. Благодаря гидрофобным взаимодействиям белки при большой молекулярной массе обладают сравнительно компактной структурой, при этом компактно упакованная глобула находится в одной, наиболее устойчивой конформации.

Советский ученый М.В.Волькенштейн в 1966 году показал, что генетический код ДНК построен таким образом, что в случае произвольной замены одного нуклеотида в триплете возникшая мутация мало изменяет гидрофобность кодируемой аминокислоты. Благодаря этому обстоятельству большинство мутаций не изменяет пространственную структуру белка.

Связывание лигандов с макромолекулами. В основе функционирования многих биополимеров лежит образование комплексов между малой молекулой (ионом, гормоном, метаболитом) – лигандом – и центрами связывания, лежащими на макромолекуле. Образование комплекса лиганд-макромолекула можно рассматривать как химическую реакцию, которая характеризуется константой образования комплекса, то есть константой связывания. В ходе исследований выяснилось, что константа связывания обратно пропорциональна концентрации свободного лиганда в условиях 50% заполнения центров связывания. Из всех реакций связывания лиганда с макромолекулой наиболее хорошо изучено образование комплекса кислорода с гемосодержащими белками. На основе теоретических выкладок была разработана методика определения степени насыщения кислородом разных типов гемоглобинов человека и миоглобина. Для этого строятся кривые насыщения кислородом. Для построения этих кривых пользуются не концентрацией кислорода, а его парциальным давлением, которое прямо пропорционально концентрации кислорода в растворе. Тогда величина парциального давления, при котором 50% гемоглобина оксигенировано, будет являться мерой сродства гемоглобина к кислороду (Р50). Уменьшение значений Р50 означает увеличение константы связывания, то есть увеличение способности гемоглобина связывать кислород. По результатам исследований оказалось, что нормальный гемоглобин (HbA) будет отдавать кислород гемоглобину плода (HBF) и миоглобину мышц (Mb), то есть мера сродства к кислороду у нормального гемоглобина ниже, чем у фетального гемоглобина и миоглобина.

Кооперативное связывание лигандов. В 1909 году Хилл предложил модель связывания кислорода с гемоглобином. Согласно модели Хилла, центры связывания кислорода на молекуле гемоглобина не являются независимыми. Присоединение первой молекулы кислорода к одному из центров увеличивает сродство к кислороду других центров, а связывание двух молекул кислорода еще более облегчает связывание третьей молекулы кислорода и т.д. Такое связывание, при котором константы связывания идентичных центров изменяются по мере заполнения центров, называется кооперативным связыванием.

Хилл рассмотрел модель с максимальной кооперативностью, то есть когда связывание первого лиганда увеличивает сродство остальных центров настолько, что они заполняются практически мгновенно. Это предположение эквивалентно тому, что в любой равновесной смеси лиганда и макромолекул присутствуют в значительных концентрациях либо только макромолекулы с незанятыми центрами связывания, либо комплексы лиганда с макромолекулой, где все центры заполнены. Константа связывания в этом случае определяется выражением (1): K = [MLn]/cn[M], где [MLn], cn, [M] – соответствующие концентрации комплексов, свободного лиганда и свободных центров связывания. В этой условной реакции константа связывания представляет собой произведение соответствующих констант связывания K = (K1…..Kn). Поэтому, для удобства расчета, Хилл преобразовал выражение (1) в выражение (2): lg [Y/(1-Y)] = lgK + nlgc, где Y – степень насыщения. Это уравнение называется уравнением Хилла, а прямая, являющаяся графическим представлением зависимости lg [Y/(1-Y)] от lgc, называется графиком Хилла; её наклон равен n. Хотя уравнение 2 было выведено для случая полной кооперативности связывания лиганда всеми n центрами, тем не менее, графиками Хилла часто пользуются для анализа процессов, кооперативность которых не является полной. В этих случаях кооперативность характеризуют коэффициентом Хилла (h), который численно равен максимальному тангенсу угла наклона графиков Хилла. Так, связывание кислорода с нормальным гемоглобином, имеющим 4 гема, характеризуется h=2,9, а с эритрокруорином (аналогом гемоглобина) кольчатого червя пескожила, имеющим 96 гемов, расположенных по 8 в 12 субъединицах, характеризуется h=6. По коэффициенту Хилла определяют характер и степень кооперативности. Если h=1, то кооперативность отсутствует (например, миоглобин). При h<1 кооперативность отрицательная, то есть происходит уменьшение сродства при последовательном связывании лигандов. При h>1 имеет место положительная кооперативность , то есть усиление сродства по мере связывания лиганда. Кооперативность связывания лигандов является лишь одним из примеров кооперативных процессов в биологии, к числу которых относятся : плавление ДНК, обратимая денатурация белка, фазовые переходы в биомембранах.

Конформационные изменения молекулы гемоглобина при оксигенации. Общая концепция электронно-конформационных взаимодействий была развита советским биофизиком М.В.Волькенштейном в 1971 году. Механизм оксигенации гемоглобина является примером таких взаимодействий.

При оксигенации гемоглобина запускается механизм конформационных переходов, который заключается в изменении распределения электронов в атоме Fe2+ по d-орбиталям и их спиновое состояние, что ведет к изменению ионного радиуса железа при 13 пм. В свою очередь это изменение трансформируется в смещение связанного с гемом гистидина, что влечет за собой конформационные перестройки в третичной структуре белка, связанные с перемещениями уже до 700 пм. В результате молекула дезоксигемоглобина будет отличаться от молекулы оксигемоглобина третичной структурой всех четырех субъединиц, и их объединением в четвертичную структуру.

Гемоглобинопатии. Гемоглобинопатии – это заболевания, которые обусловлены нарушением функционирования гемоглобина в результате скрытых молекулярных аномалий. Причинами данных аномалий могут быть

  1. Нарушение связывания гема аминокислотами, которые предотвращают образование координационных связей с железом конкурирующих с кислородом лигандов (воды, фосфата). Например, гемоглобин Хаммерсмит, в котором фенилаланин, связанный с гемом с помощью гидрофобных взаимодействий, заменен на слабогидрофильный серин. Эта мутация приводит к ослаблению связи гемма с глобином.

  2. Нарушение конформации полипептидных цепей (ά-спиралей глобина). Примером служит серповидноклеточная анемия. При этом заболевании эритроциты имеют не дисковидную форму, а серповидную. Эта форма формируется в результате того, что в β-цепях Hb гидрофильная отрицательно заряженная глутаминовая кислота заменена гидрофобным валином, что ведет к образованию «стопок» белка в клетке. Эти «стопки» образуют квазикристаллические структуры, которые делают эритроциты жесткими.

  3. Нарушение α1β1- и α2β2-контактов между субъединицами, которые сопровождаются изменением четвертичной структуры. Примером может служить гемоглобин Хиросима, в котором конечный гистидин замещен аспарагиновой кислотой, образующей более слабую связь с остатками лизина α-цепи. В результате более слабых взаимодействий между субъединицами равновесие между окси- и дезоксиформами смещается в сторону оксиформы, где связи между субъединицами ослаблены.

Ферментный катализ. Одной из основных функций белка является ферментативная. Белки-ферменты способны ускорять биохимические реакции в 108 – 1010 раз по сравнению с тем, если бы эти реакции происходили бы без участия ферментов. Ферменты никогда не сдвигают химическое равновесие. Роль ферментов сводится к уменьшению энергии активации реакции, а следовательно, к увеличению константы скорости. Ферменты обладают высокой специфичностью и катализируют только определенные реакции или реакции с участием узкого класса соединений. Первой моделью, объясняющей специфичность фермента, явилась модель Фишера, согласно которой субстрат стерически соответствует активному центру фермента. Эта модель получила название ключ-замок. Согласно более поздней модели Кошланда – модели индуцированного соответствия, - присоединение определенного субстрата вызывает конформационные перестройки в ферменте, в результате чего его каталитические группы ориентируются в пространстве таким образом, что оказываются способными осуществить превращение субстрата в продукт.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата определяется уравнением Михаэлиса-Ментен: v = vmax[S]/km+[S]. Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Некоторые вещества, связываясь с ферментом, уменьшают скорость ферментативной реакции (ингибиторы) или увеличивают (активаторы). В качестве ингибиторов и активаторов могут выступать естественные физиологические вещества, регулирующие ферментативную активность, и лекарственные препараты. Различают конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Конкурентные ингибиторы связываются с активным центром фермента, образуя комплекс фермент-ингибитор, но в продукт не превращаются. При этом максимальная скорость ферментативной реакции не изменяется. Неконкурентный ингибитор связывается с фермент-субстратным комплексом, образуя продукт – неактивный комплекс – [фермент-субстрат-ингибитор]. При этом максимальная скорость ферментативной реакции уменьшается. Но существует ряд ферментов, кинетика которых не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Эти ферменты состоят из нескольких субъединиц, имеют несколько центров связывания субстрата и проявляют свойство кооперативности.