uzluga.ru
добавить свой файл
1
Влияние жидкофазных препаратов торфа на заживление экспериментальных ожогов III А степени у крыс

Холмогорская О.В., Иванищук П.П., Ратыни А.И., Калинников Ю.А.

Гоу впо ивГМА Росздрава, кафедра биологии с экологией


Одной из наиболее актуальных медицинских проблем является получение полноценных регенератов после повреждений кожного покрова. В разработке новых методов лечения ран и ожогов большое внимание уделяется условиям микроокружения раневой поверхности, в частности, доказана высокая эффективность методов лечения ожогов II и III степени во влажной среде [5,7,8,12,15]. С 1990 года на кафедре биологии с экологией ИвГМА проводится изучение закономерностей регенерации органов млекопитающих в условиях жидкой среды [2,3,9,10,11]. В ходе исследований по теме кандидатской диссертации Холмогорской О.В. было показано положительное влияние жидкой среды на скорость и полноту регенерации кожи у крыс после ожогов IIIА степени: доказан тканесохраняющий эффект 0,9% раствора хлорида натрия; показано ускорение эпителизации ожоговой поверхности в жидкой среде, уменьшение степени развития грануляций и формирование регенерата, приближающегося по своему строению к неповреждённой коже [9,10,11].

Местное лечение при поверхностных и пограничных ожогах у человека должно не только обеспечивать создание благоприятных условий для их заживления в оптимальные сроки и стимуляцию репаративных процессов, но и предусматривать защиту раны от механического повреждения и инфицирования. В настоящее время для контроля над раневой инфекцией применяется широкий арсенал местных противомикробных средств. Вместе с тем у ряда людей развивается гиперчувствительность к используемым препаратам, появляются высокорезистентные штаммы микроорганизмов [1], что диктует необходимость поиска новых средств.

В наших исследованиях в качестве жидкой среды использовались жидкофазные препараты торфа, активным компонентом которых являются гумусовые кислоты, обладающие бактерицидными, противовоспалительными, иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами [13,14]. Исследования были выполнены в рамках гранта РФФИ № 06-04-08048 «Теоретическое и экспериментальное обоснование бактерицидности препаратов на основе гумусовых кислот торфа». Препараты под общим названием ТОМЕД разработаны в Ивановском государственном химико-технологическом университете, производятся научно-производственной фирмой "Недра" г. Иваново и имеют бальнеологическое заключение для практического использования. Растворы имеют щелочную реакцию среды (pH – 9,46). Настоящая работа представляет собой предварительное исследование, целью которого было выяснить, обладают ли препараты торфа стимулирующим регенерацию эффектом, и оценить влияние различных форм и сроков аппликации препаратов торфа на заживление ожоговых ран у крыс.

Материалы и методы. Эксперимент выполнялся на 28 животных – белых беспородных половозрелых крысах самцах исходной массой 200-250 г. Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза от 13.11.1984г. №724). Ожог диаметром 1 см наносился с помощью специально разработанного устройства (рац. предложение № 2122 от 16.02.96) под эфирным наркозом в струе проходящего пара, на боковой поверхности туловища, с экспозицией 5 секунд. После этого ожоговую рану помещали в капсулу из прозрачного полимерного материала (рац. предложение № 2123 от 16.02.96). Капсула крепилась на кожу крысы с помощью тонкой пленки, смазанной специальным жидким клеем “New-skin liquid bandage”. Для предохранения капсулы от повреждения животным использовали жестяной кожух, который фиксировали на спине и боках с помощью лейкопластыря.

Животные были разделены на 7 групп, по 4 особи в каждой – одну контрольную (К) и 6 опытных, с I по VI, в зависимости от действующего агента и сроков аппликации (таблица 1). У крыс контрольной группы капсула ничем не заполнялась, и заживление раны происходило в сухих условиях, т.е. под струпом. Крысам всех опытных групп в капсулу вводили по 1 мл определённого препарата торфа (1% и 3%-ный растворы гумусовых кислот, мазь-гидрогель с 1%-ной концентрацией гумусовых кислот). Смена содержимого капсулы производилась один раз в сутки, перед новым заполнением раневую поверхность промывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

После истечения срока воздействия препаратов капсулы снимали и содержали всех животных в одинаковых условиях, отмечая время полной эпителизации дефекта. На 21-е сутки с начала эксперимента в утренние часы проводили эвтаназию путем передозировки эфирного наркоза, кусочки ткани из центральной части регенерата иссекали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации готовили парафиновые срезы и производили окраску гематоксилином и эозином, а также методом Ван-Гизона. Готовые препараты анализировали при помощи световой микроскопии по следующим параметрам: площадь и толщина эпидермиса над дефектом; площадь регенерата и его толщина, измеренная в центральной части среза. Морфометрические исследования проводили на анализаторе изображений с помощью программы "ВидеоТест-Мастер" (ООО «Иста-ВидеоТесТ», Санкт-Петербург, Россия). При статистической обработке данных определяли средние выборочные, ошибки средних и стандартные отклонения. Достоверность различия средних оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования. Во всех опытных группах эпителизация ожоговой раны происходила быстрее, чем в контроле. Наиболее быстро дефект эпителизировался в I опытной группе, разница с контролем статистически достоверна (p < 0,05). Средние сроки эпителизации ожоговой поверхности в различных группах животных представлены в таблице 2.

При измерении площади и толщины эпидермиса над дефектом было выявлено, что у животных всех групп эпидермис в зоне повреждения более или менее гипертрофирован. Наибольшая степень гипертрофии наблюдается у животных контрольной группы (таблица 2). Наименьшее значение этих показателей – у животных IV группы, различия с контролем статистически достоверны (p < 0,05); у животных I группы статистическое различие с контролем по толщине эпидермиса отсутствует. Группы II, III, V и VI по этим показателям друг от друга практически не отличаются (различие с контролем достоверно – p < 0,05, за исключением третьей группы). В опытных группах эпидермис образует многочисленные впячивания в дерму, формируя микрорельеф кожи.

В подлежащей дерме у всех животных наблюдается замещение грануляций фиброзной тканью, т.е. третья фаза раневого процесса. У животных контрольной группы образуется неполноценный регенерат рубцового типа. Основным компонентом формирующейся фиброзной ткани являются бледно-окрашенные коллагеновые волокна, направленные параллельно поверхности дефекта. Между коллагеновыми волокнами выявляются незначительные участки аморфного вещества. Фиброзная ткань располагается вплоть до внутрикожной мышцы. Имеется значительное количество разнонаправленных капилляров, заполненных эритроцитами. Во всех опытных группах, кроме II, формируются более полноценные регенераты по сравнению с контролем. Фиброзная ткань располагается поверхностно, занимая приблизительно 1/3 толщины дермы. Между коллагеновыми волокнами имеются большие промежутки. В регенератах выявляются волосяные фолликулы, сохранившие жизнеспособность под действием препаратов торфа. Количество капилляров несколько меньше, что говорит о завершении замещения грануляций фиброзной тканью. У животных второй опытной группы, где препарат наносился после 3 суток сухого заживления, результаты значительно отличаются от других опытных групп. Наблюдается формирование глубокого и обширного дефекта, затрагивающего внутрикожную мышцу. В фиброзной ткани выявляются мощные грануляции с большим количеством сосудов, коллагеновые волокна располагаются плотно. Волосяные фолликулы отсутствуют.

Площадь и толщина регенерата максимальны в контрольной группе. У животных III, IV и VI групп эти показатели достоверно меньше, чем в контроле (p< 0,05). В I группе достоверные различия с контролем наблюдаются лишь по площади регенерата, а в V – по толщине (p< 0,05). У животных второй группы достоверные различия с контролем по обоим показателям отсутствуют (таблица 2).

Обсуждение полученных данных. Известно, что в эпителизации регенерата основная роль принадлежит эпидермису кожи, окружающей дефект. На краях ожоговой раны происходит мобилизация клеток неповрежденного эпидермиса, они начинают мигрировать на грануляционную ткань. Вначале мигрируют нижележащие клетки, которые затем устанавливают тесный контакт с субстратом и начинают формировать материал базальной мембраны. Одновременно клетки, лежащие сверху первого слоя, вытягивают свои мембраны, ”переползают” через клетки первого слоя и прикрепляются к субстрату впереди них [6]. Известно, что влажная среда способствует эпителизации ран [5, 12, 15] за счёт облегчения миграции эпителиоцитов по раневой поверхности [10]. Аппликация на ожоговую поверхность всех использованных препаратов торфа ускоряет эпителизацию. Было выяснено, что для ускорения процесса эпителизации ожоговой поверхности препараты торфа необходимо наносить сразу после ожога и время их воздействия должно составлять не менее 5 суток. Наиболее благоприятный эффект на эпителизацию оказывают водные растворы гумусовых кислот, в которых значительно облегчается миграция эпителиоцитов по раневой поверхности. Эпителизация несколько задерживается под действием гелей, которые имеют большую вязкость по сравнению с водными растворами.

Важной отличительной особенностью заживления ожогов в жидкой среде является уменьшение степени вторичного некроза [9] за счёт тканесохраняющего и противовоспалительного эффекта. Известно, что зона первичного некроза, возникшая в результате термического воздействия, становится источником свободных радикалов, разрушающих мембранные структуры клеток. Разрушение мембран приводит к накоплению кислых метаболитов, которые вызывают вторичную альтерацию, усугубляя некротические изменения. Таким образом, альтеративная фаза воспаления при ожогах становится пролонгированной за счет прогрессирующего некроза [4]. Ожоговые раны могут "углубляться" также за счет инфицирования [1].

Тканесохраняющий эффект жидкостей наблюдался в исследованиях Б.А. Парамонова с соавторами при заживлении ожогов дистальных отделов конечностей во влажной среде [8]. При осуществлении данного способа лечения через раневые поверхности (в том числе через зону "паранекроза", где клетки повреждены, но еще не потеряли окончательно своей жизнеспособности) протекало большое количество жидкости, близкой по составу к плазме крови. В результате не происходило высыхания тканей паранекротической зоны, а клетки (пораженные, но не погибшие) получали лучшее питание и частично "реанимировались", при этом у пострадавших не развивались грубые рубцовые деформации.

Результаты наших исследований свидетельствует о том, что растворы и гидрогели гумусовых кислот оказывают тканесохраняющий и противовоспалительный эффект и способствуют в дальнейшем формированию более полноценного регенерата по сравнению с сухим заживлением. Под влиянием этих препаратов сохраняется жизнеспособность тканей, прилежащих к первичному ожоговому повреждению. За счёт антиоксидантных свойств гумусовых кислот и благодаря обезвреживанию кислых метаболитов в щелочной среде препаратов торфа уменьшается степень вторичной альтерации, не происходит углубления ожога. Бактерицидность препаратов предотвращает инфицирование ожоговых ран, при этом не оказывается цитотоксическое действие, замедляющее процессы регенерации, которое характерно для большинства антибиотиков и сульфаниламидов [1]. Положительные эффекты препаратов торфа проявляются при нанесении их непосредственно после ожога, то есть во время воспалительной фазы раневого процесса. Предварительное сухое заживление приводит к значительному углублению некроза и формированию на месте повреждения грубого рубца.

Выводы:

  1. Препараты гумусовых кислот ускоряют процесс эпителизации ожоговой поверхности по сравнению с сухим заживлением.

  2. Водные растворы и гели с небольшой концентрацией гумусовых кислот оказывают тканесохраняющий и противовоспалительный эффект, препятствуя углублению некроза, и способствуют формированию регенерата, приближающегося по своему строению к нормальной коже.

  3. Положительные эффекты препаратов торфа проявляются при их нанесении сразу после ожога, в первую фазу раневого процесса – фазу воспаления. Предварительное сухое заживление приводит к углублению некроза и формированию регенерата рубцового типа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Алексеев А.А, Бобровников А.Э., Терехова Р.П., Крутиков М.Г. Микробиологическая оценка эффективности антимикробных препаратов для местного лечения ожоговых ран. Комбустиология, 2009, № 37.

  2. Иванищук П.П., Ковалев А.В. Влияние жидкой среды на полноту восстановления кожи у крыс. Морфология, 1993, № 11 – 12, с. 78 – 81.

  3. Иванищук П.П., Ковалев А.В. Заживление экспериментальных ран кожи у крыс в условиях постоянного воздействия физиологического раствора: Рукопись деп. в ВИНИТИ 22.10.90 № 5436–В90. – 1990. – 8 с.

  4. Каем Р.И. Ожоги. В кн.: Воспаление. Руководство для врачей. М.: Медицина, 1995, с. 457 – 468.

  5. Мензул В.А., Брейтман Р.Ш. Новые технологии и средства для лечения ожоговых ран у детей. В кн.: Материалы научной конференции "Актуальные проблемы травматологии и ортопедии". Часть 2. Термическая травма, Нижний Новгород, 2001, с. 174 – 175.

  6. Мяделец О.Д., Адаскевич В.П. Функциональная морфология и общая патология кожи, Витебск, изд–во Витебского медицинского института, 1997, 269 с.

  7. Озяков Н.Н., Захаров С.В. и др. Простой, эффективный и экономичный метод лечения обожжённых. В кн.: Материалы научной конференции "Актуальные проблемы травматологии и ортопедии". Часть 2. Термическая травма, Нижний Новгород, 2001, с. 177 – 178.

  8. Парамонов Б.А., Малахов С.Ф., Сидельников В.О., Бадалов Б.И., Конусова В.Г., Симбирцев А.С., Крылов К.М., Агапов И.Л. Лечение ожогов дистальных отделов конечностей во влажной среде серебросодержащими препаратами. Комбустиология, 2000, № 02.

  9. Холмогорская О.В., Иванищук П.П. Морфологические особенности заживления ожогов у крыс в 0,9% растворе хлорида натрия. В кн.: Актуальные проблемы медицинской биологии. Сборник научных работ, посвящённый 65-летию открытия кафедры биологии в Сибирском медицинском университете, Томск, 2002, с. 36 – 39.

  10. Холмогорская О.В., Иванищук П.П. Морфологические особенности эпителизации термических повреждений кожи у крыс при заживлении в 0,9% растворе хлорида натрия. В кн.: Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. Выпуск 2. Сб. науч. трудов. Томск, 2002, с. 184 – 185.

  11. Холмогорская О.В., Иванищук П.П., Суракова Т.В. Изменение синтетической активности эпителиоцитов кожи у крыс в процессе заживления ожоговых ран под струпом и в жидкой среде. Цитология, 2005, т.47, № 5, с. 388 – 392.

  12. Breuing K., Eriksson E., Liu P., Miller D.R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. J. Surg. Res., 1992, vol. 52, № 1, p. 50 – 58.

  13. Inglot A.D., Sobiech K.A., Zielinska-Jenczylik J., Sypula A., Majda J., Lorenc M. Development and disappearance of tolerance to induction of interferon and tumor necrosis factor response in athletes treated with natural immunostimulant. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), 1999, 47 (4): 237-244.

  14. Pempkowiak Janusz. Special and anti-bacterial properties of fulvic acids isolated from peat. PEAT 90-Versatile Peat: Int. Conf. Peat Prod. And Use, Jyvaskyla, June 11-15, 1990, vol. 1, Jyska, 1990, p. 341.

  15. Smith D. J., Thomson P. D., Garner W. L., Rodriguez J. L. Burn wounds: infection and healing. Am. J. Surg., 1994, vol. 167, № 1A, p. 46S –48S.

Таблица 1


Опытные группы животных

№ группы

I

II

III

IV

V

VI

Содержимое капсулы

Растворы гумусовых кислот

1% гидрогель

1%

1%

1%

3%

Длительность аппликации

5 суток

5 суток


3 суток

5 суток


5 суток


7 суток

Начало применения препарата

Сразу после ожога

Через

3 суток после ожога

Сразу после ожога

Сразу после ожога

Сразу после ожога

Сразу после ожога

Таблица 2

Морфометрические параметры регенерата

Группа


Параметр


Контроль

Опыт

I

II

III

IV

V

VI

Сроки эпителизации (сут)

18,02,1

14,5*

1,7

15,8*

0,9

15,61,8

15,3*

0,7

16,02,1

16,81,7

Площадь

эпидермиса,

мм2

0,32

±0,04

0,23*

±0,05

0,23*

±0,06

0,22

±0,07

0,19

0,09

0,22

0,01

0,21*

0,04

Толщина эпидермиса,

мкм

117, 44

±19,25

97,56

15,56

86,79*±8,26

84,83

20,31

73,08*

±6,60

83,21*

17,9

84,92*

10,56

Площадь регенерата,

мм2

2,25±0,41

1,49* ±0,37

1,81

±0,58

1,54* ±0,27

1,38*

±0,50

1,54*

0,45

1,44*

0,27

Толщина регенерата,

мм

1,12±0,25

0,85

0,28

1,11

±0,12

0,64*

0,08

0,71*

0,23

0,92

0,05

0,61*

0,13

* – разница с контролем статистически достоверна, p< 0,05