uzluga.ru
добавить свой файл



9. Аффинная модификация биополимеров. Фотоаффинная модификация как метод изучения сложных ферментативных систем

  • 9. Аффинная модификация биополимеров. Фотоаффинная модификация как метод изучения сложных ферментативных систем



Аффинный реагент





Кинетические закономерности аффинной модификации

  • где EX – комплекс E с X; EZ – продукт модификации; k – константа скорости превращения E в Z.

  • Обычно концентрация EX считается квазиравновесной, т.е. принимается, что по ходу всего процесса концентрации E, X и EX связаны соотношением:

  • = Kx

  • [E] + [EX] + [EZ] = E0

  • [X] + [EX] + [EZ] = X0

  • = k[EX]



Если реагент находится в большом избытке по отношению к биополимеру, т.е. Х0>>Е0, то [X]≈Х0 на протяжении всего процесса.

  • Если реагент находится в большом избытке по отношению к биополимеру, т.е. Х0>>Е0, то [X]≈Х0 на протяжении всего процесса.

  • [EX] = и = = kкаж(E0-[EZ])

  • Это уравнение скорости псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости kкаж. Начальная скорость реакции

  • v0=

  • где Vmax=kЕ0 – максимальная скорость аффинной модификации, достигаемая при насыщающих концентрациях реагента.

  • Величины kкаж и v0 – гиперболические функции Х0. Измерив начальную скорость или kкаж при разных концентрациях реагента, с помощью линейной анаморфозы можно определить k и Kx



Основные критерии аффинной модификации

  • 1) Модификация проходит по определенным группам в каждой молекуле биополимера или в каждой субъединице в самом активном центре или вблизи него и может сопровождаться потерей биополимером (ферментом) свойственной им активности;

  • 2) Начальная скорость модификации v0 изменяется в зависимости от начальной концентрации реагента X0 по гиперболическому закону, достигая предельного значения при достаточно высоких концентрациях реагента;

  • 3) Сродство реагента к биополимеру (ферменту), характеризуемое константой диссоциации комплекса биополимер-реагент Кx , может быть определено из зависимости v0 от X0. Оно должно быть таким же, как и сродство реагента, проявляемое им в случае, когда он выступает как конкурент по отношению к природному лиганду при исследовании обратимого связывания последнего;

  • 4) Природный лиганд защищает биополимер от аффинной модификации, т.е. тормозит процесс аффинной модификации. Из зависимости v0 от концентрации реагента и природного лиганда можно определить величину константу диссоциации комплекса биополимер-природный лиганд (KY). Если речь идет об аффинной модификации односубстратного фермента, то можно определить величину константы Михаэлиса для субстрата KM. Эта величина может быть больше KY или равна ей.



Если наряду с реагентом X в реакционной смеси присутствует нереакционноспособный конкурент Y (природный лиганд)

  • Условие материального баланса для фермента следует заменить на

  • [E] + [EX] + [EY] + [EZ] = E0

  • Для взаимодействия этого лиганда с полимером условие материального баланса и квазиравновесия:

  • [EY] + [Y] = Y0

  • = Ky

  • где Ky – константа диссоциации комплекса нереакционноспособного конкурента.



Если конкурент взят в количестве, намного превышающем количество биополимера, то [Y]≈Y0 . В этом случае кинетическое уравнение остается уравнением псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости

  • Если конкурент взят в количестве, намного превышающем количество биополимера, то [Y]≈Y0 . В этом случае кинетическое уравнение остается уравнением псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости

  • kкаж = и v0 =

  • Линейная зависимость Лайнуивера–

  • Берка для 1/kкаж как функции 1/X0.

  • В серии экспериментов с постоянным

  • значением Y0 и изменяющимся значением X0

  • точки ложатся на прямую, пересекающую

  • ось ординат при значении 1/kкаж = 1/k.

  • Значение Kx определяется из экспериментов

  • в отсутствие нереакционноспособного

  • конкурента Y.



  • где Q – продукт (продукты) превращения Y.

  • Для описания ферментативного превращения Y обычно используют квазиравновесное приближение:

  • = k’1[E][Y] – (k’-1+ k’2)[EY] = 0

  • и, следовательно, (KM)Y

  • где (KM)M – константа Михаэлиса для субстрата Y. В этом случае в выражение:

  • v0 =

  • вместо KY следует подставить (KM)Y. Эта величина может существенно превышать KY=k’-1/k’1, если k’-1 того же порядка или меньше, чем k’2.



Особые случаи

  • Аффинная модификация одноцентрового фермента может проходить по нескольким группам, локализованным в самом активном центре или вблизи него.

  • В случае более сложных ферментов и механизмов превращения реагента зависимость начальной скорости модификации от концентрации реагента может иметь насыщающий характер, но не быть гиперболической. Эта зависимость может проходить через максимум или иметь точки перегиба.

  • Возможны ситуации, когда не наблюдается защитного эффекта природного лиганда от модификации или он резко занижен.

  • Для многосубстратных ферментов могут появиться новые критерии, сформулированные на основе кинетического анализа более сложных схем аффинной модификации. Например, в случае функциональных димеров можно наблюдать взаимодействие аффинного реагента с двумя активными центрами.

















Преимущества фотоаффинной модификации при исследовании многокомпонентных комплексов, например, репликативного комплекса

  • Возможность изучения быстро протекающих изменений в области контакта участников процесса: ферментов, ДНК-матрицы и dNTP при помощи быстрого фотохимического мечения фермента фотоактивируемыми аналогами dNTP или праймера, которое можно осуществить за миллисекунды, используя импульсное облучение.

  • Фотоактивируемые группы позволяют определить взаимное расположение отдельных субъединиц всех участников репликации относительно ДНК и друг друга и исследовать динамику функционирования таких систем.

  • В случае фотореагентов, содержащих арилазидогруппы, существует возможность вариации длины линкера и типа арилазидогруппы, что способствует повышению эффективности и селективности модификации биополимера.









Репликативный белок А человека (RPA)

  • RPA – основной эукариотический SSB-белок, как и прокариотические SSB, играет ключевую роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК.

  • Структура: стабильный гетеротример, состоящий из трех субъединиц с молекулярными массами 70, 32 и 14 кДа.

  • Основная функция – стабилизация одноцепочечных участков ДНК. Кроме того, RPA обладает способностью к расплетению двуспиральной структуры ДНК. Эта функция естественно связана с его способностью удерживать однонитчатые участки ДНК в расплетенном состоянии.













Фотоактивируемые аналоги dNTP являются эффективными субстратами ДНК-полимераз и могут быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных ДНК-субстратов, либо интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в частности репликации и репарации ДНК, с последующей фотоаффинной модификацией ферментов-участников этих процессов метаболизма ДНК.

  • Фотоактивируемые аналоги dNTP являются эффективными субстратами ДНК-полимераз и могут быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных ДНК-субстратов, либо интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в частности репликации и репарации ДНК, с последующей фотоаффинной модификацией ферментов-участников этих процессов метаболизма ДНК.















Методы высокоселективной модификации ферментов

  • Использование реагентов, соответствующих аналогам субстрата, имитирующим переходное состояние, через которое происходит превращение субстрата в продукт.

  • Каталитически компетентное мечение (ККМ).

  • Модификация с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов (БСФР).





Бинарная система фотоаффинных реагентов



А) Белок-мишень содержит центр связывания для двух субстратов.

  • А) Белок-мишень содержит центр связывания для двух субстратов.

  • Б) Образование комплекса белка-мишени с радиоактивно меченым фотореагентом и сенсибилизатором.

  • В) Во время облучения энергия изначально поглощается сенсибилизатором, а затем переносится на фотоактивируемую группу реагента. Реагенты, связанные вне активного центра и находящиеся в растворе, не возбуждаются.

  • Г) Реагент ковалентно присоединяется в связывающем центре белка-мишени.